HPLC مخفف عبارت High Performance Liquid Chromatography است. “کروماتوگرافی” تکنیکی برای جداسازی، “کروماتوگرام” حاصل کروماتوگرافی .ابزاری است که برای انجام کروماتوگرافی استفاده می شود.
HPLC چیست ؟
HPLC مخفف عبارت High Performance Liquid Chromatography است.
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا چیست؟
“کروماتوگرافی” تکنیکی برای جداسازی، “کروماتوگرام” حاصل کروماتوگرافی. ابزاری است که برای انجام کروماتوگرافی استفاده می شود.
در میان فنآوریهای مختلف توسعهیافته برای کروماتوگرافی، دستگاههای اختصاص داده شده برای جداسازی مولکولی به نام ستونها و پمپهای با کارایی بالا برای تحویل حلال با سرعت جریان پایدار، که برخی از اجزای کلیدی کروماتوگرافها هستند.
با پیچیدهتر شدن فناوریهای مرتبط، سیستمی که معمولاً به عنوان کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا شناخته میشود، به سادگی «LC» نامیده میشود.
امروزه، کروماتوگرافی مایع با کارایی فوق العاده بالا (UHPLC) که قادر به تجزیه و تحلیل با سرعت بالا است، نیز گسترده تر شده است.
فقط ترکیبات محلول در حلال ها را می توان با HPLC آنالیز کرد.
HPLC ترکیبات محلول در یک نمونه مایع را جدا می کند و امکان تجزیه و تحلیل کیفی و کمی را در مورد اینکه چه اجزایی و چه مقدار از هر جزء در نمونه وجود دارد را می دهد.
شکل 1 یک نمای کلی از فرآیند HPLC را نشان می دهد. حلال مورد استفاده برای جداسازی اجزای یک نمونه مایع برای تجزیه و تحلیل HPLC فاز متحرک نامیده می شود.
فاز متحرک به یک ستون جداسازی، که در غیر این صورت به عنوان فاز ثابت شناخته می شود. و سپس به آشکارساز با نرخ جریان پایدار که توسط پمپ تحویل حلال کنترل و تحویل داده می شود.
مقدار مشخصی از نمونه به ستون تزریق می شود. و ترکیبات موجود در نمونه جدا می شوند. ترکیبات جدا شده در ستون توسط یک آشکارساز در پایین دست ستون شناسایی شده و هر ترکیب شناسایی و کمی سازی می شود.
دستگاه HPLC
“نمای کلی فرآیند HPLC” (همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است) و مکانیسم های آن اکنون پوشش داده شده است.
با پرداختن به جزئیات بیشتر، HPLC از اجزای مختلفی تشکیل شده است. از جمله یک پمپ انتقال حلال، یک واحد گاز زدایی، یک نمونه انژکتور، یک کوره ستونی، یک آشکارساز و یک پردازشگر داده در شکل 2 نمودار جریان HPLC و نقش هر جزء را نشان می دهد.
همانطور که برای HPLC، پمپ فاز متحرک را با نرخ جریان کنترل شده (a) تحویل می دهد. هوا می تواند به راحتی در فاز متحرک تحت فشار اتمسفر استانداردی که در آن زندگی می کنیم حل شود.
اگر فاز متحرک حاوی حباب های هوا باشد و وارد پمپ تحویل شود. ممکن است مشکلاتی مانند نوسانات سرعت جریان و نویز/ رانش پایه ایجاد شود. واحد گاز زدایی با حذف حباب های هوا در فاز متحرک (b) به جلوگیری از این مشکل کمک می کند. پس از حذف هوای محلول، فاز متحرک به ستون تحویل داده می شود. سپس انژکتور نمونه یک محلول استاندارد یا محلول نمونه را وارد فاز متحرک (c) می کند.
نوسانات دما می تواند بر جداسازی ترکیبات در ستون تاثیر بگذارد. ستون را در کوره ستونی قرار می دهند تا دما را ثابت نگه دارد(d). ترکیبات شسته شده از ستون توسط یک آشکارساز که در پایین دست ستون (e) قرار می گیرد، شناسایی می شوند. یک ایستگاه کاری سیگنال آشکارساز را برای به دست آوردن کروماتوگرام برای شناسایی و کمیت ترکیبات (f) پردازش می کند.
جداسازی HPLC
HPLC می تواند هر ترکیب را با تفاوت سرعت هر ترکیب در ستون جدا کرده و تشخیص دهد. شکل 3 نمونه ای از جداسازی HPLC را نشان می دهد.
برای HPLC دو فاز وجود دارد: فاز متحرک و فاز ثابت. فاز متحرک مایعی است که ترکیب مورد نظر را حل می کند. فاز ساکن بخشی از یک ستون است که با ترکیب هدف تعامل دارد.
در ستون، هرچه میل ترکیبی (مثلاً نیروی واندروالس) بین جزء و فاز متحرک قویتر باشد. مؤلفه سریعتر از طریق ستون همراه با فاز متحرک حرکت میکند.
از طرف دیگر، هر چه میل ترکیبی با فاز ساکن بیشتر باشد، کندتر از ستون حرکت می کند. شکل 3 نمونهای را نشان میدهد که در آن مولفه زرد میل ترکیبی قوی با فاز متحرک دارد و به سرعت در ستون حرکت میکند، در حالی که مولفه صورتی میل ترکیبی قوی با فاز ساکن دارد و به آرامی حرکت میکند. سرعت شستشو در ستون به میل ترکیبی و فاز ساکن بستگی دارد.
چگونه کروماتوگرام را بخوانیم
کلمه کروماتوگرام به معنای نموداری است که از طریق کروماتوگرافی به دست می آید. شکل 4 نمونه ای از کروماتوگرام را نشان می دهد. کروماتوگرام یک نمودار دو بعدی با محور عمودی است که غلظت را بر حسب شدت سیگنال آشکارساز نشان می دهد و محور افقی نشان دهنده زمان تجزیه و تحلیل است.
هنگامی که هیچ ترکیبی از ستون شسته نمی شود، یک خط موازی با محور افقی ترسیم می شود. به این خط مبنا می گویند. آشکارساز بر اساس غلظت ترکیب هدف در نوار شستشو پاسخ می دهد. طرح به دست آمده بیشتر شبیه به شکل زنگ است تا مثلث. به این شکل “قله” می گویند.
(tR) فاصله زمانی بین نقطه تزریق نمونه و اوج پیک است. زمان لازم برای ترکیبات باقیمانده (ترکیبات بدون برهمکنش برای فاز ساکن) برای رفتن از انژکتور به آشکارساز، زمان مرده (t0) نامیده می شود.
ارتفاع قله (h) فاصله عمودی بین راس قله و خط پایه است و ناحیه قله (A) که به رنگ آبی روشن رنگ شده است ناحیه محصور شده توسط قله و خط پایه است. این نتایج برای تجزیه و تحلیل کیفی و کمی اجزای یک نمونه استفاده خواهد شد.
